Propranolol jako potencjalna terapia w leczeniu raka jelita grubego – nowe odkrycia

Czy propranolol może wspierać leczenie raka jelita grubego?

Badanie in vitro przeprowadzone przez zespół naukowców miało na celu ocenę efektów przeciwnowotworowych propranololu (PRO) – nieselektywnego beta-blokera stosowanego w chorobach układu sercowo-naczyniowego – na różne linie komórkowe raka jelita grubego (CRC). Badanie to stanowi część szerszego nurtu badań nad repurposingiem leków, czyli wykorzystaniem zatwierdzonych już preparatów w nowych wskazaniach terapeutycznych, co umożliwia szybsze wprowadzenie potencjalnie skutecznych terapii przeciwnowotworowych przy ograniczonych kosztach.

Badana populacja obejmowała cztery linie komórkowe raka jelita grubego: HCT-116 i HT-29 (reprezentujące pierwotny CRC) oraz SW-480 i SW-620 (reprezentujące zaawansowany/przerzutowy CRC). Linie te charakteryzują się różnymi profilami mutacji, w tym w genach PIK3CA, KRAS, BRAF i TP53, co pozwoliło na zbadanie odpowiedzi na PRO w kontekście różnych aberracji molekularnych.

Jak propranolol wpływa na cytotoksyczność komórek CRC?

Wyniki badania wykazały, że propranolol indukuje cytotoksyczność w sposób specyficzny dla typu komórkowego i zależny od dawki oraz czasu ekspozycji. W teście Trypan Blue najbardziej wrażliwa na PRO okazała się linia SW-480, ze znaczącym spadkiem żywotności komórek już przy stężeniu 10 μM. Komórki HT-29 wykazały umiarkowaną wrażliwość (istotne efekty od 40 μM), podczas gdy HCT-116 i SW-620 były najmniej wrażliwe, wymagając odpowiednio 80 i 160 μM dla osiągnięcia istotnego efektu cytotoksycznego. Test MTT potwierdził te obserwacje, pokazując dodatkowo, że wartości IC₅₀ dla PRO wzrastały wraz ze zwiększającą się gęstością komórek, ale malały przy dłuższym czasie ekspozycji.

Propranolol istotnie modyfikował morfologię komórek nowotworowych, powodując zmiany w błonach komórkowych, zmniejszenie konfluencji oraz pojawienie się ciałek apoptotycznych. Co istotne, PRO hamował zdolność komórek CRC do tworzenia kolonii nawet po zastąpieniu medium zawierającego lek medium bez leku, co sugeruje długotrwały efekt przeciwnowotworowy.

Czy PRO indukuje apoptozę i modyfikuje cykl komórkowy?

Analiza mechanizmu śmierci komórkowej wykazała, że PRO indukuje apoptozę w różnym stopniu w badanych liniach komórkowych. W komórkach HCT-116 (z mutacjami PIK3CA i KRAS) PRO znacząco zwiększał odsetek komórek we wczesnej (16,22% vs 1,70% w kontroli) i późnej fazie apoptozy (20,61% vs 5,93%). W linii HT-29 (z mutacjami PIK3CA, TP53 i BRAF) obserwowano silną indukcję zarówno wczesnej (24,73% vs 4,50%), jak i późnej apoptozy (39,60% vs 15,66%). W liniach SW-480 i SW-620 (obie z mutacjami TP53 i KRAS) PRO indukował głównie późną apoptozę, bez wykrywalnej nekrozy.

Propranolol wpływał również na dystrybucję faz cyklu komórkowego. W liniach HCT-116 i HT-29 powodował zatrzymanie w fazie G0/G1, zwiększając populację komórek w tej fazie do około 59% (w porównaniu do 43-47% w kontroli). W linii SW-620 PRO stymulował zatrzymanie w fazie S (29,51% vs 24,33% w kontroli) i zmniejszał odsetek komórek w fazie G2/M. Analiza cyklu komórkowego w fazie sub-G1 wykazała, że zastosowanie PRO w liniach HCT-116, HT-29 i SW-480 zwiększało odsetek komórek w porównaniu z kontrolą.

Jakie są zmiany w poziomach reaktywnych form tlenu po leczeniu PRO?

Interesujące wyniki uzyskano w analizie poziomów reaktywnych form tlenu (ROS). W komórkach HT-29 PRO zwiększał poziom wewnątrzkomórkowych ROS (43,16% vs 28,05% w kontroli), podczas gdy w pozostałych liniach obserwowano redukcję ROS. W linii HCT-116 poziom wewnątrzkomórkowych ROS był obniżony do 59,06% w porównaniu z kontrolą (84,15%). Podobnie w liniach SW-480 i SW-620 odnotowano znaczące obniżenie poziomów wewnątrzkomórkowych ROS po leczeniu PRO, odpowiednio do 35,70% vs 54,86% w kontroli i 12,86% vs 54,06% w kontroli. Intensywność zielonej fluorescencji, proporcjonalna do ilości wewnątrzkomórkowych ROS, była wyższa tylko w komórkach HT-29 traktowanych PRO w porównaniu z kontrolą.

W przypadku mitochondrialnych ROS, PRO znacząco zwiększał ich generację w liniach HT-29, SW-480 i SW-620, ale nie w HCT-116, co sugeruje różne mechanizmy indukcji apoptozy w zależności od profilu genetycznego komórek. Obrazowanie fluorescencyjne wykazało wyższą intensywność czerwonej fluorescencji w komórkach HT-29, SW-480 i SW-620 traktowanych PRO w porównaniu z kontrolą, co odzwierciedla wpływ PRO na indukcję mitochondrialnego stresu oksydacyjnego poprzez nadmierną produkcję mitochondrialnych ROS (superoksydu).

Jak propranolol wpływa na migrację komórek CRC?

Badanie wykazało również, że PRO hamuje migrację komórek CRC w sposób specyficzny dla typu komórkowego i zależny od czasu. Ekspozycja na PRO znacząco zmniejszyła migrację komórek HCT-116 po 24 i 48 godzinach, jednak nie zaobserwowano istotnej zmiany po 72 godzinach w porównaniu z komórkami kontrolnymi. W przypadku HT-29, PRO istotnie wpłynął na zdolność migracji komórek po 72 godzinach. Zdolność migracyjna komórek SW-480 była znacząco hamowana przez PRO we wszystkich badanych przedziałach czasowych, podczas gdy w komórkach SW-620 hamowanie zdolności migracyjnej było istotne po 48 i 72 godzinach. Najsilniejszy efekt antymigracyjny obserwowano w linii SW-480. W komórkach HT-29, SW-480 i SW-620 zaobserwowano tendencję do obumierania i unoszenia się w grupach traktowanych PRO po 48 i 72 godzinach.

Czy terapia PRO + CAP przynosi synergistyczne efekty przeciwnowotworowe?

Szczególnie istotne wyniki uzyskano w badaniu synergistycznego działania propranololu w połączeniu z capecitabine (CAP) w metastatycznej linii SW-620. Wartość IC₅₀ dla CAP w komórkach SW-620 wynosiła 5 mM i została wykorzystana do obliczenia indeksu kombinacji w stałym stosunku z PRO. Terapia łączona wykazała synergistyczne działanie przeciwnowotworowe, co zostało potwierdzone przez obliczenie indeksu kombinacji.

Obrazy mikroskopowe wykazały, że leczenie PRO + CAP powoduje wyraźne zmiany w morfologii komórek SW-620, takie jak zmniejszenie rozmiaru komórek, utrata adhezji i tworzenie ciałek apoptotycznych w porównaniu z komórkami nieleczonymi. Analiza cytometryczna wykazała, że terapia kombinowana znacząco indukowała późną apoptozę w komórkach SW-620 (32,24% vs 11,03% w kontroli), silniejszą niż każdy z leków stosowany osobno. PRO aktywował późną apoptozę, podczas gdy chemioterapia CAP nie aktywowała apoptozy. Dodatkowo, monoterapie PRO lub CAP generowały wysokie poziomy mitochondrialnych ROS, podczas gdy leczenie PRO + CAP prowadziło do nadmiernej generacji mitochondrialnych ROS.

Obrazy fluorescencyjne wykazały większą intensywność czerwonej fluorescencji w grupie leczonej kombinacją leków w porównaniu z kontrolą, co sugeruje większy mitochondrialny stres oksydacyjny spowodowany nadmierną generacją mitochondrialnych ROS (superoksydu), prowadzący do indukcji mitochondrialnej apoptozy w komórkach SW-620 leczonych terapią podwójną. Ponadto, terapia podwójna wpływała na cykl komórkowy SW-620 poprzez zatrzymanie komórek w fazach G0/G1 i S oraz zmniejszenie populacji komórek w fazie G2/M. W przypadku komórek leczonych terapią podwójną, populacja komórek znacząco wzrosła do 34,50% w fazie G0/G1 w porównaniu z kontrolą (27,90%). W fazie S populacja komórek wzrosła do 30,02% w porównaniu z kontrolą (23,50%), podczas gdy populacja komórek w fazie G2/M zmniejszyła się do 28,43% w porównaniu z kontrolą (39,60%).

Jakie perspektywy otwiera badanie PRO w leczeniu CRC?

Wyniki tego badania wskazują, że propranolol może być wartościową opcją terapeutyczną w leczeniu zarówno pierwotnego, jak i zaawansowanego raka jelita grubego. Badanie to ma istotne znaczenie, ponieważ ocenia skuteczność leczenia PRO na ludzkich liniach komórkowych CRC w różnych warunkach eksperymentalnych, w tym różnych liniach komórkowych, zwiększających się gęstościach komórek i kilku punktach czasowych. Wyniki te stanowią podstawowe odniesienia dla przyszłych badań. Co ważne, nasze badanie dostarcza informacji na temat hamowania tworzenia kolonii i potencjału antymigracyjnego leczenia PRO w warunkach in vitro.

Dane wykazały, że dodanie PRO do linii komórkowych CRC (HCT-116, HT-29, SW-480 i SW-620) miało zróżnicowany wpływ na cytotoksyczność, tworzenie kolonii, apoptozę, progresję cyklu komórkowego, wewnątrzkomórkowe ROS, mitochondrialne ROS i migrację komórek. Badanie to ujawniło znaczące przeciwnowotworowe działanie tego schematu w przedklinicznych modelach zaawansowanego CRC. Dlatego zastosowanie pierwotnych linii komórkowych CRC może zwiększyć ich właściwości przeciwnowotworowe. Badanie przedklinicznych modeli CRC z niezmutowanymi stanami niektórych proto-onkogenów i genów supresorowych nowotworów mogłoby mieć dodatkowy wpływ. Ponadto, obserwowana in vitro synergia w terapii podwójnej PRO + CAP podkreśla potencjalne korzyści terapeutyczne w leczeniu przerzutowego CRC i wymaga dalszych badań in vivo.

Podsumowanie

Badanie in vitro nad przeciwnowotworowym działaniem propranololu (PRO) na różne linie komórkowe raka jelita grubego (CRC) przyniosło obiecujące rezultaty. Wykazano, że lek indukuje cytotoksyczność w sposób zależny od typu komórek, dawki i czasu ekspozycji, przy czym największą wrażliwość wykazała linia SW-480. PRO skutecznie hamował tworzenie kolonii nowotworowych i indukował apoptozę, wpływając również na cykl komórkowy komórek. Szczególnie istotne okazało się synergistyczne działanie propranololu w połączeniu z capecitabine (CAP) w przypadku przerzutowej linii SW-620, gdzie zaobserwowano wzmocnione działanie przeciwnowotworowe. Badanie wykazało także, że PRO moduluje poziomy reaktywnych form tlenu (ROS) oraz hamuje migrację komórek nowotworowych. Te odkrycia sugerują, że propranolol może stanowić wartościową opcję terapeutyczną w leczeniu zarówno pierwotnego, jak i zaawansowanego raka jelita grubego.